本文为重庆公安用户投稿。

[摘要] 目的 触碰微量检材的DNA有效图谱的获取一直是DNA检验的难点，建立一种简便快捷鉴定指印样本DNA方法。方法 利用意大利copan公司新研制出microFLOQ® 直扩拭子采集指印样本，直接扩增后电泳获取的图谱，对比利用传统采集，提取纯化的传统方法后电泳获取的图谱相比较。结果 直扩获取的图谱比传统方法获取的图谱包含更全面的信息。结论 microFLOQ® 直扩拭子直扩方案是一种提取微量DNA的获得完全STR分型图谱的不错方案，它简便，高效。

[关键词] 法医物证；DNA样本采集；直扩；指印；microFLOQ®  

Preliminary study on fingerprint sample after direct amplification using microFLOQ® swabs

[Abstract] Objective To establish a simple and rapid method for DNA identification of fingerprint samples. Methods The fingerprint samples were collected by microFLOQ® Direct product which is newly developed by the company of Copan Italy. Using the direct PCR to obtain the profile was compared with that obtained by traditional methods. Results the profile obtained by direct PCR contains more comprehensive information than that obtained by traditional methods. Conclusion Direct amplification swab is a good method to obtain complete STR typing profile by extracting trace DNA. It is simple and efficient.

[key words] frensic DNA; DNA sample collection; direct PCR; fingerprint; microFLOQ®

前言：

microFLOQ® 直扩拭子（图1）是意大利copan公司新研制出的提取拭子^[1]，它的拭子头结构和copan公司 4N6 FLOQSwabs®系列产品一样^[2]，采用电喷植绒技术将短尼龙纤维垂直植入拭子头，由于这种结构使得拭子没有核心内部吸附区域，不会让样品分散并锁困于其内，样品只能被吸附于拭子头表面，利于后期样品的释放和溶解。有研究表面这种设计能提高DNA回收效率除了上述结构设计外，新型的直扩拭子头部被设计附有裂解剂可以用于直扩，无需提取及纯化，并且拭子头很小，拭子柄设计了易折点，便于直接在扩增管里操作避免二次污染^[3-4]。本文初步研究了microFLOQ® 直扩拭子对指印提取的直扩方案的效果，并与传统手工方案进行了比较。阐述了该方案的优势和可能面临的问题和挑战。

材料与方法：

指印样本制备

一名测试者在按指印前用洗手液清洗双手，15分钟后将一张黑色经过高压灭菌和紫外照射处理过的相片纸放于电子秤上，让测试者用食指和无名指用大概200g力同时按压相片纸15s，留下指印样本。

指印样本擦取和保存

将生物物证专用棉签（北京布兰特警用装备有限责任责任公司）的头部蘸取无菌水后用200g力度按由上到下，从左至右各15次将相片纸上食指指印全部覆盖擦拭。随后将棉签擦取处用洁净经过灭菌和紫外照射处理过的剪刀剪入QIAGEN套管内保存。将microFLOQ® 直扩拭子头部蘸取无菌水后用同样力度和方法将相片纸无名指指印全部覆盖擦拭。随后将直扩拭子套入外盖保存。

传统手工方法对样品DNA提取及纯化

采用QIAGEN M48试剂盒提取生物物证专用棉签提取的样品DNA，在 QIAGEN套管中加入190μL G2试剂和10μL 20mg/ml的蛋白酶K溶剂。在56℃水浴锅中放置30min，随后14000crf离心，去除套篮，加入600μL MTL试剂和16μL磁珠悬浮液，利用Mixergenis 生物翻转摇匀仪最小转速混匀15min后放入磁力架上待磁珠沉淀后用WZ-Ⅱ真空泵将上清去除，用500μL 80%乙醇漂洗两次，加入100%乙醇漂洗一次后放入博日恒温加热器上65℃干燥15min,最后加入25μL 超纯水放入博日恒温加热器上56℃温浴5min，常温保存。

直扩拭子的PCR扩增

将套管保存2小时左右的擦取样品的直扩拭子头折入PCR管中，采用GlobalFiler^TM试剂盒在9700扩增仪上进行PCR反应。扩增反体系为10μL，其中引物混合液1μL，反应混合液3μL，超纯水6μL。反应条件为95℃ 1min/（94℃ 10s/59℃ 1min30s）×29/60℃ 10min/4℃永久。设置阳性对照组为含有1μL 007 DNA,引物混合液1μL，反应混合液3μL，超纯水5μL和新的无提取样品的直扩拭子头用于检测直扩拭子头中的裂解剂是否对PCR反应体系产生抑制作用。阴性对照组为加入引物混合液1μL，反应混合液3μL，超纯水6μL和新的无提取样品的直扩拭子头。

传统手工方法样品DNA的扩增

取经过纯化过的DNA样品6μL作为模板，用同样的条件和体系进行PCR扩增，设置阳性对照组为加入007 DNA同样反应体系。阴性对照组为加入相应体积的超纯水。

DNA检测、分离和分析

取1μL扩增产物加入9μL含LIZ600内标（2%体积浓度）的Hi-Di^TM甲酰胺溶液利用3500遗传分析仪进行分离检测，同时加入1μL的等位基因分型标准物用于分型分析。电泳采用用POP-4^TM胶灌注的36cm毛细管，进样条件为1.2kv, 15s。STR分型分析采用GeneMapperID-X软件1.5版本，相对荧光单位（RUF）检测阈值为50，基因座相对荧光单位（RUF）值计算为纯合型值为该位点值，杂合型值将等位点值相加。

结果与讨论：

microFLOQ® 直扩拭子直扩方案与传统手工提取方案比较

    由于直扩省去了提取和纯化的过程，相比传统手工方案能节省大量的时间并减少工作量，并且由于传统手工提取操作步骤相比繁琐，增加了操作过程中出错和污染的机会，之前已经有很多相关的研究报道。相比之前的胶带粘取直扩，PE拭子直扩，棉绳粘取直扩等直扩方法在收集样本后都必须后期的剪取操作^[6]，由于microFLOQ® 直扩拭子易折点和套管设计，是目前真正实现从收集到PCR扩增最简便的直扩方法。

microFLOQ® 直扩拭子头中裂解剂的对反应体系的抑制评估

    在添加了无提取样品的直扩拭子头的007 DNA的阳性对照组中获得了和无添加的 007 DNA的阳性对照组全部24个位点的一致STR分型结果，且在绝大多数位点的峰高大致相同，大片段位点和小片段位点的峰高比较均一，部分位点峰出现了明显差异有可能是PCR随机效应导致的。实验结果和Angie 等人开展的实验结果相同^[5]，说明microFLOQ® 直扩拭子头中裂解剂不会对PCR反应产生干扰或者抑制作用。

直扩和传统手工提取的DNA图谱比较

直扩图谱和手工提取图谱如图2、图3，与该测试人员之前获取的血样DNA图谱比较发现，直扩图谱获得了包含与血样图谱完全一致的分型结果，而手工提取图谱在D8S1179、D21S11、CSF1PO、D3S1358、D13S317、D12S391出现了等位基因缺失。但是直扩图谱在D21S11、D5S818、AMEL、DYS391出现了疑似插入位点 。特别在AMEL、DY391基因座上可以明确判定为插入位点。因为测试人员为女性。在手工提取的DNA图谱中AMEL同样出现插入位点结果，通过对照分析我们认为很有可能是由于二次转移残留外源DNA造成结果，因为测试人员在清洗双手后的15min这段时间使用过公共电脑和处理纸质文件。通过对图谱的比对分析发现直扩方案检测的灵敏度高于传统方案。

直扩和传统手工提取的DNA各基因座的相对荧光单位（RUF）值比较

我们进一步对直扩方案和传统方案各基因座的相对荧光单位（RUF）值进行了统计分析如图4，发现传统方案除了在CSF1PO、D12S391、D21S11、D2S441、D8S1179、FGA、TPOX外的15个基因座上的相对荧光单位（RUF）值均高于直扩方案，并且传统方案的各基因座总相对荧光单位（RUF）值高于直扩方案。有相关文献报道，相对荧光单位（RUF）值和样本DNA量存在正相关性，说明传统方案获得的扩增总DNA模板高于直扩。但是图谱比较的结果上传统方案没有直扩方案好。并且我们从相对荧光单位（RUF）值统计表上发现一个很有意思的现象，传统方案在基因座相对荧光单位（RUF）值低于500的基因座CSF1PO、D12S391、D21S11、D3S1358、D8S1179除TPOX外存在等位基因丢失，而直扩方案在基因座相对荧光单位（RUF）值低于500的基因座CSF1PO、D10S1248、D1S1656、D21S11、D3S1358、D5S818、D7S820、TPOX却不存在此现象。我们分析以上现象可能是原因是传统方案获得DNA的质量不如直扩方案(传统的提取和纯化可能将大片段基因组打散成小片段，对后续的扩增产生影响,D3S1358基因座等位基因丢失可能是随机效应)。

结论：

microFLOQ® 直扩拭子直扩方案是一种提取微量DNA的获得完全STR分型图谱的不错方案，它简便，高效。本次实验仅采用了一名测试样本，该方案的可靠性和可重复性还有待验证。它在现场实际操作中还面临诸多挑战，如现场样本中是否存在一些抑制因子影响后续扩增反应^[7]，它对现场样本的在时间上的保存能力等等。

参考文献：

[1] COPAN product brochure for forensic and genetics applications, http://www.copanusa.com/products/forensic-genetic/.

[2] A.Dadhania, M. Nelson, G. Caves, R. Santiago,et al. Evaluation of Copan 4N6FLOQSwabs® used for crime scene evidence collection[J] Forensic Sci. Int. Genet,Supp. Series 4 (2013):e336–e337.

[3] COPAN 4N6 FLOQSwabs® DNA collection and preservation for human identificationbrochure, http://www.copanflock.com.

[4] microFLOQ® Direct product brochure, http://products.copangroup.com/index.php/products/forensics/microfloq-direct.

[5] Angie Ambers, Rachel Wiley, Nicole Novroski,et al.Direct PCR amplification of DNA from human bloodstains, saliva, and touchsamples collected with microFLOQ® swabs[J]Forensic Science International: Genetics,2018,32:80–87.

[6] Jason Y. Liu, PE-Swab direct STR amplification of forensic touch DNA samples[J] J.Forensic Sci,2015, 60 (3):693–701.

[7] Schrader, A. Schielke, L. Ellerbroek, et al.PCR inhibitors – occurrence, properties and removal, [J]J. Appl. Microbiol,2012,113 (5): 1014–1026.

图1 A：直扩拭子外观，B：直扩拭子头

Fig.1 A: The appearance of microFLOQ® swabs,B:The tip of microFLOQ® swabs 

图2 传统手工方案获得图谱

（箭头所指峰有极大可能是影子峰，但也可能是插入等位基因。星星表示插入等位基因，不能确定其提供的人员信息）

Fig.2 The profile from a fingerprint using the traditional extraction method

Arrows(↓)indicate the peaks that are likely high stutter but may be drop-in alleles.Stars(★)indicate drop-in alleles that cannot be attributed to a known individual.

图3 直扩方案获得图谱

（图标含义同上）

Fig.3 The profile from a fingerprint after direct amplification using microFLOQ® swabs

The meaning of the icon is the same as above

图4 直扩和传统手工提取的DNA各基因座的相对荧光单位（RUF）值比较

Fig.4 Comparison of average signal(RUF) per locus from fingerprint after direct amplification using microFLOQ® swabs versus traditonal extraction method.