+86 400-6625-126
三代测序技术准确率飞跃之谜
高错误率常被认为是三代测序技术的主要特征之一。不够准确的长读长测序，就像锋利而命中率不高的飞镖，破空而去，却射不中目标，不免令人失望。
然而近几年，情况似乎发生了变化。三代测序准确率有了明显的提升。它在科研界似乎从幕后走向台前，应用实例变多了，受到的关注也日渐增多。这其中发生了什么？
> HiFi测序的诞生：一遍读不准，那就多读几遍咯
HiFi测序由PacBio公司开发，意思是High-Fidelity（高保真）测序。你可以认为是SMRT测序技术的进阶版。它兼具长读长和高准确率，也是目前正在推广和应用的、最具代表性的版本。
准确率之所以提升，主要是因为它采取了一种被称作Circular Consensus Sequencing (CCS)的测序模式。有人将CCS翻译为“环化共有序列”，听起来很唬人，但如果把两个词拆开来理解可就容易多了。
首先是Circular。在HiFi测序流程中，样品先被打断为一定长度的双链DNA分子（>10 kb）后，然后其两端被接上发卡结构的接头序列（Hairpin adapters）。两条链接续起来，构成哑铃形状，如下图所示。把它展开以后就是一个由DNA正链、反链和接头序列组成的环状分子。由此构建的文库叫做SMRTbell Library。
与Illumina和其他二代测序技术相似，SMRT测序过程是边合成边测序（Sequencing by synthesis），也就是说，以待测DNA为模板进行DNA复制，在合成新链的同时，通过检测新捕捉的核苷酸来确定DNA序列。HiFi测序的模板就是上述带有发卡接头的、环化了的DNA分子。由于两条链已经连接起来，DNA复制过程不存在断点，聚合酶能够在这个环状模板上跑完一遍又一遍，进行周而复始的滚环复制。这是CCS测序模式得以实现的基础。
SMRT测序技术本身的准确率不高，DNA聚合酶在环状模板上跑一次测得的序列准确率通常在90%以下。但由于测序错误的产生是随机的，这种错误可以用一个极其简单直接的方法来矫正，那就是：多跑几遍。
就好像是你有一群不聪明但很认真的孩子，你无法直接阅读一本书，而只能通过他们来间接获取关于这本书的信息。他们会向你逐字逐句地转述书的内容，但每个人都可能随机地在10-15%的字词上出错。
于是，通过比对、得到一致性序列，可以得到高准确率的测序结果。相当于让这些孩子围坐在一起讨论，所达成的共识（Consensus）部分，就可以认为是准确的。因为所有孩子在同一字词上犯错的概率极小。
如下图所示，当你有5个“孩子”，能够实现Q20（99%）以上的准确率，而当你有10个“孩子”，即在环状模板上跑10次（10 passes），准确率就能达到Q30（99.9%）。
听起来简单粗暴、量大管饱，但实现起来没那么容易。前文所说的，发卡接头将两条链接续起来后DNA连续复制是理想状况，实际上，导致DNA复制过程的中断另有其他因素，比如样品DNA本身。DNA的损伤会让聚合酶在复制中途脱落，从而使测序过程中断。因此，CCS测序模式非常依赖于样品DNA质量。需要预先筛选出高质量DNA分子，最大程度地减少受损DNA的比例，才能有效地实现高准确率测序。
另外，pass次数不可能是无限的，测序准确率的提升也是有天花板的。在环状模板上周而复始地复制，对于DNA聚合酶来说是连轴转的苦力活。它很容易就过劳死了，不可能在那个环上工作到天荒地老。
> 纳米孔测序的进阶：工欲善其事，必先利其器
与PacBio HiFi测序的“电梯直达”式的进阶之路不同，ONT提高纳米孔测序准确率的道路要显得曲折一些，更像是阶梯式的螺旋上升。
在发展纳米孔测序技术的早期阶段，ONT也曾采取与CCS相似的方法。他们也在样品DNA上连接发卡接头，只不过是其中的一端，而不是两端。这样将两条链串联起来以后，马达蛋白先牵引模板链通过纳米孔，发卡接头和另一条互补链紧随其后，从而一次完成两条链的测序，相当于对一条序列正着测又反着测，测了两次，因此ONT称之为2D模式。读取的序列则被称作2D read。对某种特定的纳米孔而言，例如ONT的R9.4纳米孔，2D模式下的测序准确率从原先1D模式下的86%提升到94%。
继2D模式后，ONT于2017年推出了1D2测序方法。他们为DNA分子的两条链分别接上一种特殊的接头，该接头大概率能使互补链和模板链被同一个纳米孔所捕获，但不能确保这一事件的发生（概率>60%）。
但由于两种测序技术在测序原理和过程上存在本质的不同，CCS策略在PacBio的SMRT测序中一路高歌的盛况，却在纳米孔测序中难以复现。纳米孔测序为边解旋边测序（不是边合成边测序），一经解旋便无法恢复，所以是一过性的，不支持反复跑、反复测。另外，核苷酸链一旦通过纳米孔，以目前的技术，应该是没法让同一条链反向再次通过同一纳米孔。所以HiFi测序中5个pass、10个pass对于Nanopore测序来说几乎不可能实现。
对纳米孔测序而言，纳米孔本身与马达蛋白的优化，可能才是属于它的康庄大道。
ONT从未停止过改进纳米孔和马达蛋白的步伐。2014年的R7纳米孔测序准确率仅为64%左右，而2016年推出的R9纳米孔一下子把准确率提升至～87%。根据ONT官网提供的数据，R10.4.1在特定的测序条件下，可以达到99.9%以上的准确率。
事实上，获取共有序列（Consensus sequence），即对同一序列的多个拷贝进行测序，或者对同一序列多次测序，是消除随机误差的常见方法。采取此方法的测序准确率也被称作Consensus accuracy。除了HiFi测序的CCS模式以外，还可以通过扩增样品DNA、提高测序深度、算法矫正等方式来提高准确率。ONT纳米孔测序的最新版本R10.4.1，其Consensus accuracy据说可以达到99.999%（10-20x测序深度）。
在2021年发表于Nature Methods上的一篇文章中，作者将一种早已用在单细胞转录组测序研究中的独特分子标志符（Unique molecular identifier, UMI）与三代测序技术结合。UMI是一串随机的寡核苷酸序列，每一条UMI都独一无一。它被嵌入到模板DNA时，则成为一种分子标签。可以认为它是DNA分子的“身份证”。通过识别这串随机字符，能够识别扩增后的DNA分子来源于哪一条模板DNA。考虑到三代测序错误率高的特点，作者采取了特殊的UMI设计，并通过数据过滤，有效地提高了UMI识别能力，从而把ONT纳米孔测序的错误率降低到了0.0042%（R10.3），把PacBio的HiFi测序错误率降低到了0.0007%。
不过，在测序前先对模板DNA进行扩增的做法，似乎没有让三代测序技术发挥它单分子测序的优势。现在的三代测序技术稳中求进，但好像缺乏一种颠覆性的创新，或者一股磅礴的能量，让它彻底沸腾起来。否则仅有长读长这一项优势，相关的数据处理软件也尚未成熟，它将很难超越或者替代二代测序。
至于技术，从来都没有什么秘密，无非是千万次地优化，不断地改进罢了。
1. https://www.pacb.com/technology/hifi-sequencing/ 2. https://nanoporetech.com/platform/accuracy 3. Karst, S.M., Ziels, R.M., Kirkegaard, R.H. et al. High-accuracy long-read amplicon sequences using unique molecular identifiers with Nanopore or PacBio sequencing. Nat Methods 18, 165–169 (2021). 4. Wang, Y., Zhao, Y., Bollas, A. et al. Nanopore sequencing technology, bioinformatics and applications. Nat Biotechnol 39, 1348–1365 (2021).
本文转载自微信订阅号“不懂不知”，如有侵权，请联系弘德网删除。
