当我们提到“二代”这个词时，通常认为它意味着初代技术基础上全面的革新与进步。然而，比起传统的Sanger测序，市面上常见的二代测序平台读长较短（50-300 bp），准确度也有所不及。那么，它是凭什么被称作二代测序（Next-generation sequencing, NGS），又是凭什么占领市场，成为目前应用最为广泛的一类测序技术呢？

    这得从它最基本的特征说起——

> 更高通量，更低成本

    二代测序也叫高通量测序（High-throughput sequencing）。2005年，当NGS初次进入市场时，它还有另外一个名字，大规模并行测序（Massively-parallel sequencing）。

    NGS可以说是人类基因组计划时代的产物。尽管在2003年，这项宏大的科学探索工程就宣告完成，但其影响之深远，并不限于它进行时的年代。

    人类基因组草图的绘制主要由一代测序技术，即Sanger测序技术完成。对于整个基因组多达30亿对碱基的解析工作来说，早期的Sanger测序方法无疑是极为低效的。为了提高效率，早在1986年，美国Applied Biosystems（ABI）公司就在Nature杂志上提出了Sanger测序的自动化方案，随即推出了首台自动化测序仪，ABI Prism 370A。

> 改进手段1: 采用荧光基团标记四种碱基

    在最初的Sanger测序流程中，测序反应分为四部分进行。每个反应只加入一种碱基的双脱氧核苷酸（ddNTP），并且分别进行独立的凝胶电泳来检测反应产物。光凝胶电泳就得跑四个，更别提那之后那繁琐的肉眼辨认、手动分析工作了。

    ABI公司采用四种不同颜色的荧光基团对碱基进行标记，因此在反应结束时，可以将反应产物混合，然后仅运行单根凝胶电泳管，即可完成所有产物的分离与检测。荧光数据由计算机自动获取，并根据荧光波长（颜色）来判断是A、T、C、G中哪种碱基。

> 改进手段2：采用毛细管阵列电泳技术进行产物分离与检测

    毛细管电泳（Capillary electrophoresis, CE）是以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的液相分离技术。由于采用了内径仅25-100 μm的毛细管和高达数千伏的高压，它的分离效率更高，分离速度更快，样品消耗量更低。也由于单根毛细管体积小，容易实现多根毛细管的集成，从而提高分析通量（同时运行多根毛细管）与分离效率。

    利用毛细管电泳技术而不是传统的凝胶电泳技术，于1998年推出的ABI Prism 3700真正地实现了规模化测序。改进后的版本3730xl可同时运行96道毛细管电泳，适配96孔板，一次能够完成96个样品的测序。目前，像3730xl这样的自动化Sanger测序仪仍有较为广泛的应用，可用来验证NGS测序结果的准确性（Sanger测序依然是测序界的“金标准”）。

    借助四色荧光标记和毛细管阵列电泳这两种手段，Sanger测序的效率和通量有了显著的提升。但是，这样就够了吗？

    在人类基因组计划完成时，据说，一个人的基因组测序成本接近5000万美元。要知道，NGS的目标可是“1000美元测整个人类基因组”。从50,000,000到1000，不止是四个0的距离。为了把基因测序"拉下神坛"，让它“飞入寻常百姓家”，通量上仅仅是“显著”的提升是不够的。

    它需要质的飞跃。

> NGS如何实现高通量

    我们这里提到的“通量”，一般指的是某个系统可同时进行的反应数目。它和效率、速度这些词的意思不同，但相辅相成。高通量往往意味着快速、高效——千万个反应同时进行，肯定比一个一个地反应更快、更爽嘛！

    二代测序技术的所谓“高通量”，你可以理解为：跑一次测序反应，它可以测得的DNA分子数/碱基数很多，非常多。

    大幅度提高通量，是实现低成本测序的必经之路。

    为了实现高通量，首先，NGS基本上沿用了荧光标记法来区分A、T、C、G四种碱基。该方法简单方便，已经发展得非常成熟。

    在此基础上，我们可以设想一下，最简单的实现高通量测序的方式是什么。

    很可能是这样的：把所有需要测序的DNA分子分散在一个平面上，再加入四种碱基的ddNTP，进行DNA合成，然后利用光学检测系统同时检测所有的DNA分子——根据每个分子的荧光信号，判断该分子在此次反应中结合的是哪种碱基的ddNTP，并用计算机自动记录每个分子在该位置的碱基。

    但可惜的是，单个DNA分子的荧光信号极其微弱，无法达到现有的光学检测系统的检出限。

    那么，当务之急就是：增大信号强度。由于DNA可以复制，具备天然优势，则可以通过DNA扩增，增加同种DNA分子的数目（这些分子必须聚集）来实现这一点。

    打个比方，当一个人孤零零地举着发光的手电筒站在地面上，那点光亮对于高空中的观察者来说是完全看不见的。但当这个人叫来成千上万的人，每个人都举着手电筒，扎堆站在一起，那么，高空中的观察者就会看到一个明显的光点。

    不同的NGS技术用于聚集同种DNA分子的方式可谓是八仙过海各显神通。比如454测序技术是把DNA分子捕获在固态微球上，然后再把微球分散在不同的微孔里，将每个合成反应限制在独立的微孔中进行（孔内修饰化学发光反应所需的酶和底物）。于是由每条原始DNA分子扩增得到的所有分子都聚集在其所处的微孔里。

    Illumina测序技术则与之不同。沿用我前面提到的类比来描述：454技术是在地上画了个大圈，勒令所有举着手电筒的人站在圈内，不能走出圈外；而Illumina技术在这个例子里要显得魔幻一些，是预先在地上均匀地打上木桩（人必须站在木桩上），然后让第一个人A以手拉手的方式召唤出第二个人B，B站在与A相邻的木桩上。B再手拉手召唤出C……于是整体呈现出扎堆的效果。

> 桥式扩增：手牵手，好朋友

    众所周知，桥式扩增是illumina测序技术的关键特点之一。

    Illumina的测序反应在流动槽（Flow cell）中进行，而每个流动槽包含8条泳道（Lane）。通道表面均匀地修饰了两种寡核苷酸。每次测序前，待测样品中的DNA片段的两端也会被接上两种接头序列，与通道内的寡核苷酸互补。当样品进入通道，每条DNA分子和与之互补的寡核苷酸结合。接着进行DNA复制，在寡核苷酸的基础上形成互补链。然后DNA变性，洗去原先的模板链，只留下互补链。

    该互补链从通道上其中一种寡核苷酸延伸而来，是扎根在通道表面上的。而它的另一端，也和通道上的另一种寡核苷酸互补。于是，有趣的地方来了，它会弯曲，“尾部”不动，“头部”则与邻近的寡核苷酸互补结合，像一个人做仰卧推起成桥的动作。然后就以这个“桥”为模板，在第二种寡核苷酸的基础上延伸出DNA分子。

    成桥，解桥……如此反复，由于每条DNA分子只能和与之相邻的寡核苷酸“牵手搭桥”，所以PCR扩增时，只会从原始DNA分子一点一点地往外扩散，最终聚集性地扩增出足量的DNA分子，形成簇（Cluster）。这些簇产生的荧光信号足够强，能够被光学检测系统有效地捕捉。

> 短读长：高通量测序反应的必然事件

    如前所述，NGS“高通量”的实现离不开待测DNA分子及其荧光信号的聚集。比如在Illumina测序平台上，需要先形成Cluster，而每个Cluster由大量的、一端固定在通道表面上的同序列DNA分子组成。在测序反应中，Cluster的同序列分子将同时与某种碱基的脱氧核苷酸反应，并同时释放出同种颜色的荧光分子。

    因此，每个Cluster的荧光信号的强弱非常依赖于其中DNA分子的测序反应的同步性。一旦有一部分分子漏了一拍，产生错误，这些错误将随着读长的延长而逐步累积。当累积到了一定程度，Cluster发出的荧光信号中红的红，黄的黄，绿的绿，难以准确辨别，这个Cluster就会作废。

    实际的反应不可能像严谨的计算机程序那样指哪打哪。就如同我前面举的那个例子：那些扎堆的人中，有些人是急性子，有些人是慢性子，有些反应迟钝，有些快人一步。一开始还好好的，说好的举黄色光的手电筒，就齐刷刷放黄光；次数多了，错误就会越来越多。到最后，颜色不一致，乱成一团，那高空中的观察者就会犯迷糊：这到底是什么颜色的光啊？

    所以说，如果二代测序采取的是我所说的技术路线，短读长现象就必然发生。

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