DNA甲基化（DNA methylation）为DNA化学修饰的一种形式，能够在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现。所谓DNA甲基化是指在DNA甲基化转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5'碳位共价键结合一个甲基基团。大量研究表明，DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。DNA甲基化在干细胞维持和自我更新与分化，个体的衰老和发育异常及疾病（如肿瘤、糖尿病、精神病及神经系统疾病等复杂疾病）的发生发展中起着决定性的作用。

        随着高通量测序技术的发展，我们能够从全基因组水平来分析5’-甲基胞嘧啶，这就是 “DNA甲基化测序”！且近年来测序成本的不断下降及测序技术的迭代更新，DNA甲基化测序方法可选择性更多了。

        目前表观遗传学DNA甲基化研究测序方法常见的有：全基因组重亚硫酸盐甲基化测序[WGBS]、简化甲基化测序[RRBS]、甲基化DNA免疫共沉淀测序[MeDIP-seq]、甲基化捕获测序[Methyl-Seq]、甲基化芯片检测[EPIC2.0]等5种。

        全基因组重亚硫酸盐甲基化测序（WGBS）可以在全基因组范围内精确的检测所有单个胞嘧啶碱基（C碱基）的甲基化水平。可以检测全基因组所有位点的甲基化水平；是一种时间比较早，比较通用的检测技术。

        常规全基因组甲基化测序技术通过T4-DNA连接酶，在超声波打断基因组DNA片段的两端连接接头序列，连接产物通过重亚硫酸盐处理将未甲基化修饰的胞嘧啶C转变为尿嘧啶U，进而通过接头序列介导的 PCR 技术将尿嘧啶U转变为胸腺嘧啶T，进而区分该碱基胞嘧啶C是否发生了甲基化。

技术优势：

        💠 全基因组覆盖：最大限度地获取完整的全基因组甲基化信息；

        💠 单碱基分辨率：可精确分析每一个C碱基的甲基化状态。

技术缺陷：

        💠 价格昂贵，性价比不高，不适合做大量样本；

        💠 测序深度低，人的样本，90G数据量平均深度在12-15X。

        简化甲基化测序(Reduced Representation Bisulfite Sequencing,RRBS)是利用限制性内切酶对基因组进行酶切，富集CpG位点相对比较集中的区域并进行重亚硫酸盐测序。该技术提高了高CpG区域的测序深度，主要在CpG岛、区域可以获得高精度的分辨率。

技术优势：

        💠 单碱基分辨率：在其覆盖范围内可达到单碱基分辨率；

        💠 性价比高：测序区域针对高CpG区域，数据利用率更高。

技术缺陷：

        💠 重复性低：技术的重复性大概只有85%-95%；

        💠 测序深度：10g的数据量，平均测序深度30X,测序深度大于30X的位点，占比比较低。

        MeDIP-Seq（Methylated DNA Immunoprecipitation Sequencing）测序是基于抗体富集原理进行测序的全基因组甲基化检测技术，采用甲基化DNA免疫共沉淀技术，通过5'-甲基胞嘧啶抗体特异性富集 基因组上发生甲基化的DNA片段，然后通过高通量测序可以在全基因组水平上进行高精度的CpG密集的高甲基化区域研究。

技术优势：

        💠 成本低：大大降低了测序数据量（每个样本数据只需1-2G），测序成本低；

技术缺陷：

        💠 单碱基分辨：无法检测单个位点的甲基化值，分辨率在50-100bp。

        Methyl-Seq（Methylated DNA Target Sequencing）测序是探针捕获原理进行测序的全基因组甲基化检测技术，实验原理有点类似全外显子测序，然后通过高通量测序可以在全基因组水平上进行高精度的CpG密集的高甲基化区域研究，设计区间在全基因组水平CpG islands、CpG island shores、CpG island shelves、 undermethylated 区域、启动子、肿瘤及组织特异性甲基化区域 (DMR)、增强子、Ensemble 调控区域和DNase I 高敏感位点。

技术优势：

        💠 单碱基分辨率：在其覆盖范围内可达到单碱基分辨率；

        💠 测序深度：数据量测到15G可达到80-100x的测序深度，性价比高；

        💠 重复性高：技术重复相关性R²>0.97；

        💠 可以进行甲基化单倍型分析；

        💠 甲基化状态不受snp位点的影响；

        💠 可根据客户需求灵活设计不同的panel。

技术缺陷：

        💠 目前产品化的靶向甲基化测序产品只能检测人、大鼠、小鼠。

        illumina 甲基化芯片（EPIC)是基于芯片杂交捕获单碱基延伸的原理设计的一款芯片，目前已经升级从最开始的27K、450K、850K升级到935K芯片，芯片也通过不断的改进，完善升级到目前认为最优的版本，甲基化芯片也是全基因组覆盖的一款产品，全面覆盖CpG岛、启动子、编码区、 开放染色质和增强子。此外还包括CpG岛外的CpG位点，已知DMR位点，脱氧核糖核酸酶超敏位点以及miRNA启动子区域。

技术优势：

        💠 单碱基分辨率：在其覆盖范围内可达到单碱基分辨率；

        💠 重复性高：技术重复相关性R²>0.99；

        💠 有大量的公共数据库可以利用。

技术缺陷：

        💠 不适合甲基化区段的分析。

        最后小编说一下自己对这几个技术的看法，仅代表个人看法，无利益倾向。

        在这几种技术中MeDIP-Seq和RRBS都是至少十几年的技术了，小编认为目前出现的新的技术已经把这些技术慢慢替代了。

        WGBS虽然也很久了，这个技术在位点覆盖程度上是无可替代的，比如一些内含子区域的甲基化。只不过是拿到这些位点的甲基化信息是否对研究真的有意义。以及低深度测序带来的数据准确性的问题，是个需要思考的问题。

        935K芯片和甲基化捕获测序，个人认为是我们目前研究甲基化最好技术手段。935K芯片经过450K和850K芯片这些版本优化，在稳定性上是现有技术无法媲美的。甲基化捕获测序我个人觉得就像WGS发展成WES一样。在提高了测序深度的同时，节约测序成本，这点在大队列研究中极为重要。另外就是甲基化捕获测序后期可以进行定制化捕获测序，可以根据前期筛选的位点进行定制，这一点是现有技术都做不到。尤其在临床转化上优势极为明显。