性侵案件是一类比较特殊、性质恶劣的犯罪行为，其特殊性在于这类案件一般是没有目击证人的，所以此类案件的破获只能依赖于现场所获得的检材。而在此类案件中获得的检材往往是含有女性阴道分泌物和男性精液的混合斑迹检材。如何将这类混合斑迹彻底分离，准确认定其中精子的个体来源是案件侦破和诉讼的关键。

经过科研人员多年来的不懈努力，目前已开发出多种方法来分离混合斑中的男性和女性成分。例如差异裂解法、显微镜操作法、微流控芯片法、流式细胞术法、激光捕获显微切割技术、免疫磁珠法等，这些方法都有报道和应用的成功案例，也各有其特点和利弊。

差异列解法是Peter等在1985年开发建立的。这种方法的主要原理是基于体细胞及精子细胞这两种细胞中的DNA包装形式不同。体细胞中的DNA是以组蛋白八聚体组成核小体的形式包装在细胞核中。

而精子细胞体积较小无法通过组蛋白形式进行包装，在精子细胞中的DNA以鱼精蛋白代替了组蛋白，其中主要以精氨酸为主，另外有一些苯丙氨酸残基，这会形成稳定的二硫键。从而导致了普通蛋白酶无法直接消化精子细胞。所以在第一步蛋白酶K消化的时候只有女性细胞被裂解，而精子细胞仍然保持完整，从而可以实现男性和女性成分的分离。

差异裂解法

差异裂解法凭借其对设备要求低、实验成本低廉、回收效率高等优势，历经30多年仍在广泛使用，仍是当前实验室分离混合斑的主流方法。当然，基于差异裂解法原理，法医DNA工作者也开发出多种改进的方法，如硅珠法、differex法、Dnase-I法、精子富集柱法等。

差异裂解法第一步都是使用蛋白酶裂解女性成分细胞，裂解时间一般最少要4个小时，多数情况下为了保证女性细胞裂解彻底需要过夜处理。第二步离心沉淀，洗涤。第三步再加DTT，蛋白酶，SDS等裂解精子细胞，然后经过纯化后即可得到单一的精子DNA。

此过程耗时较长，一般需要数小时甚至十几小时。另外，操作过程中需要多次移液操作，以及精子DNA的纯化过程，可能会造成精子细胞的损失。不利于紧急案件的快速侦破以及精子细胞较少的检材的DNA提取。

快速差异裂解法

为了提高差异裂解速度，国内学者也做了相关的研究。比如在“第六届全国法医DNA检验技术研讨会”中，王老师在《快速差异裂解法分离混合斑中精子》的报告中提到采用多次短时间消化女性细胞的方法，可大幅缩短DNA的提取时间。

王老师在研究中每次消化15分钟，然后补充蛋白酶再次消化，重复3至4次消化，可将女性成分裂解时间缩短至1小时左右，并且相对于传统单次裂解，女性成分消化更为彻底。该方法也成为王老师所在实验室分离精子DNA的常规方法。

王老师的快速差异裂解法在传统的方法上做了一定的改进，提高了DNA的检验速度。

快速差异裂解试剂

瑞源公司的“混合斑快速分离试剂盒”是一款商业化的混合斑快速分离试剂盒，其基本原理仍采用差异裂解法原理。第一步女性成分裂解采用了跟王老师类似的短时多次裂解法，将裂解时间缩短至1小时。

在后续的操作中这款试剂盒做了极大的优化，我们不再采用常规的离心沉淀再洗涤的方法，而是使用了更加高效的精子富集柱。这样我们可以在单管中实现多级裂解，无需反复移液，仅需加液、离心即可实现男性和女性成分分离以及洗涤过程。

另外，对于精子细胞裂解我们也采用了与PCR兼容的高温酶裂解方式，高效、快速且无需DNA纯化即可直接用于DNA检验。这些改进都将精子细胞损失降到最低，非常利于精子细胞非常少的检材的 DNA提取。同时整个操作流程也缩短至1.5小时，为案件的快速侦破提供了先决条件。