法医DNA新技术的应用和发展使得DNA检验灵敏度不断提高,法医DNA实验室的DNA污染问题引起人们关注。为了有效地避免DNA污染,获得稳定、可靠的检验结果,法医DNA实验室要建立严格的防污染措施和相应的污染监测体系来防范DNA污染,一旦发现DNA污染,还要查找原因,提出解决方案。

1 DNA污染及来源

    DNA污染(DNAcontamination)是指生物物证检材在提取或检验过程中混有含DNA的外源生物物质,造成DNA检验的结果发生改变。DNA污染属于物证污染的一种,但与其它专业的污染有所不同。由于目前常用的法医DNA技术是针对现场提取到的、与人有关的各种生物物证进行检验,具有人的种属特异性(humanspecies2specific),这里提到的外源DNA(exogenousDNA)一般特指人基因组DNA,而不是其它的非人DNA。在生物物证检材保存过程中如果保存方法不当,样本中存在的微生物DNA等非人DNA,可能会造成物证DNA的降解,从而影响检验结果,但是在实验室内利用现有的DNA检验方法检测不到非人DNA,不会造成DNA污染。

    法医DNA实验室中的外源DNA有3个来源:

    1)检验技术人员的DNA;

    2)实验室其它样本中含有的DNA;

    3)检验过程中的PCR扩增产物或等位基因标准对照物(allelicladder)。由实验室内技术人员自己的DNA引起的DNA污染称作自身污染(selfcontamination),多是由于操作人员在检验过程中的疏忽造成;由实验室内其它样本DNA引起的DNA污染称作交叉污染(crosscontamination),多是由于检材保管或提取DNA时操作不当造成;由PCR扩增产物或等位基因标准对照物引起的DNA污染称作PCR污染(PCRcontamination),多是由于实验室设计、管理或操作不当造成。

    当技术人员自身的DNA遗留在实验室用具或消耗品等物品上时,自身污染也可以是通过交叉污染的方式造成(PCR污染也是同样)。

2 实验室防污染措施

    每个人在日常生活中都被DNA包围着,人的任何活动都有可能留下DNA,对DNA检验造成污染。有些DNA污染,能够通过重新的检验加以纠正,而有些污染(如对极少量物证检材的污染)则可能造成不可弥补的损失,所以对于DNA污染,法医DNA实验室要重在预防,建立一整套完善的防污染的制度,

并严格贯彻执行。

2.1 实验室的环境和设施

    法医DNA实验室对环境和设施严格控制,实行分区域管理和定期清洁制度,是避免DNA污染的有效手段。

2.1.1 实验室分区 

由于法医DNA检验的高灵敏性,为了防止检验过程中的交叉污染,法医DNA实验室应建立实验室分区和授权进入制度,各区域间的通风、排气系统不得混用,无关人员不得进入实验区域,不同区域的实验设备及器械不得混用。

    DNA实验室的分区域管理,能够保证在不同的实验区域内完成不同的检验,按照DNA含量由少到多的顺序,实现检材和样本的单方向流动。DNA实验室必须设置案件受理和检材保管区、样品DNA提取区、DNA扩增区、DNA检测区[4],有条件的实验室还应设置初检区、结果分析区、准备区等,其中DNA扩增区和检测区还应设置缓冲区,供技术人员更换工作服。对于微量DNA的检验,如接触DNA等,由于检材含有的DNA量少,更存在污染的危险,要设置专门的DNA提取区域。

    PCR污染是法医DNA实验室的特点,也是实验室污染防范的重点。在PCR扩增产物或等位基因标准对照物中含有高浓度的DNA目的片段,极少的量就会被检测到,实验室一旦发生此类污染,将很难清除,后果严重。对实验室实行分区管理,严格按要求操作,能够有效地预防污染发生,其中重点要对DNA检测区进行严格管理。含有扩增产物或对照物的离心管只能在DNA检测区打开,不允许带出该区域;处理检测区的废物时要封装严密;技术人员进出该区域要更换工作服。

2.1.2 实验室清洁 

做好实验室的清洁工作是防止DNA实验室内发生交叉污染的有效途径。造成DNA交叉污染的原因多种多样,主要是物证检材之间或比对样本与物证检材之间的相互污染。DNA交叉污染的方式可以是直接接触造成,也可以是通过一定的载体使外源DNA发生转移造成,使DNA检验结果错误;前者容易发现和预防,后者则较难发现和预防,这要求实验室要做到定期清洁和消毒。

    实验室的清洁范围包括对工作台面、仪器设备表面、重复使用的工具或器皿等的清洁。工作台面重点部位包括实验室受理检材的柜台、DNA提取工作台、吸取DNA的超净台和检材存储柜等都是容易接触并遗留DNA的区域;仪器设备主要有离心机的转头、提取DNA用的加热块、扩增仪的样品槽、移液器杆的吸孔、遗传分析仪的加样槽等;重复使用的工具或器皿主要有剪取检材样本使用的剪刀及镊子、配制试剂所用的试剂瓶等。

    实验室清洁主要是采用擦拭清洗的办法,先用新鲜配制的10%漂白液(7mM次氯酸钠溶液)将需要清理物体的表面反复擦拭,再用75%乙醇擦洗以去除残留物,可以有效清除它们表面附着的各种污染物,条件允许的情况下定时进行紫外灯照射消毒[5]。实验室除要建立定期清洁制度外,一旦发现在检验过程中有可能发生DNA污染时,要及时清理和清洁。

2.2 技术人员的操作

在各种情况下,实验结果的准确、可靠,首先要依赖于实验室内技术人员的操作,应该说技术人员是影响DNA鉴定结果的主要因素。技术人员在进行DNA检验的过程中要时刻树立防污染的意识,警惕任何可能造成DNA污染的操作和步骤,严格按照操作要求进行检验,才能达到防止污染的目的。

2.2.1 个人防护 

    法医DNA实验室内技术人员说话或咳嗽时飞溅的唾液、脱落的头皮屑等含有大量的DNA,在实验过程中都可能造成自身DNA的污染,所以技术人员要采取个人保护措施,防止污染发生。由于DNA检验技术人员本身在检验过程中不注意或操作不当造成的DNA污染并不少见。2004年,美国华盛顿警察局犯罪实验室在调查23起DNA检验造成错误鉴定的原因时,发现其中8起案件是由于技术人员自身DNA污染造成,另有8起由于DNA交叉污染造成。

    DNA实验室内技术人员在检材交接、保存、初检及提取DNA时,必须穿戴好实验室工作服、一次性手套、面罩(或口罩)、发罩(或帽子);进行其它检验操作时,也必须穿工作服、戴手套,进出DNA扩增区及检测区时,还应在缓冲区更换工作服,防止空气中含有扩增产物的气溶胶颗粒被带入其它区域造成污染。

2.2.2 器具和消耗材料的使用 

    DNA检验使用的各种器具和消耗材料都有可能是携带外源DNA的载体,操作中如果不慎会造成DNA污染。实验过程中,要尽量使用一次性用品或器具,其中包括手套、移液用的吸头、离心管等;使用的手套在接触可能含有DNA的物品后要及时更换,当打电话、触摸计算机键盘等时要除去手套;重复使用的器具,如剪刀、镊子等,处理物证检材后要及时更换;实验区内备用的离心管、吸头、剪刀、镊子、干净的棉签拭子等用具要封装严密;为了防止移液器头部的DNA污染,还可以使用防止气雾的吸头(aero2solresistanttip)。

2.2.3 DNA提取 

    从检材样本中提取DNA是DNA检验的开始,也是最容易造成DNA自身污染和交叉污染的步骤。为了避免DNA污染,现场提取物证检材和比对样本提取DNA时要分开在不同区域操作,对于不具备条件的实验室,也要分开在不同时间分别提取物证检材和比对样本DNA;处理物证检材时,不要把多件检材放在一起,一次只应处理一件物证检材,不要把检材直接放在工作台面上,每次都要放置新的衬纸垫,做到及时更换衬纸垫和手套;提取DNA时,先处理检材DNA含量少的物证,再处理检材DNA含量多的物证,防止造成DNA量少的物证检材的污染。

2.2.4 DNA扩增和检测 

    DNA扩增和产物检测的过程中要注意避免PCR污染的产生。扩增时,由于样品多,要注意不要加错样,把已加样完的样品移离原来的位置,与未加样样品分开,可以防止此类错误,有条件的实验室,可使用自动化工作站;打开含有DNA的离心管前要在离心机中瞬时离心,以使溶液处于管底,防止开盖时溶液渗出或飞溅;DNA检测区的一切物品,尤其是含扩增产物的离心管严禁带入DNA提取区和扩增区。

2.3 试剂及消耗品的防污染质量控制

    法医DNA实验室所使用的试剂及消耗品的质量能否满足要求是保证DNA检验结果准确的基础。2002年,英国法庭科学服务中心(FSS)的DNA实验室在DNA检验中曾因离心管被生产工人的DNA污染而导致错误地串并数起刑事案件,误导了警察对案件的调查[7],使我们认识到质量控制(qualitycontrol,QC)的重要性。

    DNA实验室为了在检验中获得准确、可靠的结果,在关键试剂和消耗材料使用前要对其进行质量控制检验,确认其指标合格后才能用于DNA检验。DNA实验室的关键试剂主要是指DNA纯化试剂盒和STR复合扩增试剂盒,关键消耗材料是指离心管、吸头、棉签拭子等。对于不同批次的试剂或消耗材料,必须对每一批次分别进行质控检验;对于同一批次的试剂或消耗材料只需对随机抽取的样品进行质控检验。质控检验是用质控对象分别对已知DNA分型的阳性对照(posi2tivecontrol)和不含DNA的阴性对照(negativecontrol)进行DNA检验,如果阳性对照的结果分型正确,阴性对照的结果不含谱带,就表明质控对象合格。质控合格的试剂或消耗材料要标记质控日期和有效期,再用于DNA检验。

3 实验室DNA污染监测和发现

    DNA实验室一旦发生DNA污染,就会产生错误的结论,这就要求实验室要有一套监测和发现DNA污染的措施,通常采取设置对照样本、核查DNA图谱质量、建立DNA排查库等办法加以解决。值得一提的是这些检测污染的方法起不到预防DNA污染的作用,只是能够发现检验过程中存在的一些污染,但不能够发现所有的DNA污染。

3.1 设置对照样本

    在DNA检验过程中,平行设置不同类型对照样本的检验,根据检验结果来判断在操作中是否存在DNA污染,是对法医DNA实验室DNA污染进行监测的好方法,实验室的技术人员必须按照要求进行操作。2002年,美国的联邦调查局(FBI)的DNA实验室发生的技术人员未按照操作规范进行阴性对照检验,无法确定在检验过程中是否有DNA污染的存在,导致百余起案件重新鉴定,一些DNA结果从国家DNA数据库中被删除,一些物证检材因没有检验条件而无法做出鉴定结论,严重影响了FBI的声誉。

    DNA检验中设置的对照样本有阴性对照和阳性对照两种。

3.1.1 阴性对照 

    阴性对照,又称空白对照(blankcontrol),是指平行实验中设置的不含DNA

样品的检验,主要有PCR阴性对照、试剂空白对照和检材空白对照三种。PCR阴性对照是在PCR反应时用水代替模板DNA进行反应的对照,主要用于监测PCR反应体系和PCR检验过程中DNA污染情况;试剂空白对照是使用所有检验试剂平行对空白样品进行检验的对照,主要用于监测检验全过程所用试剂的DNA污染情况;检材空白对照是对空白检材的载体样本(不含检材斑迹的载体)进行平行检验的对照,主要用于监测载体样本的DNA污染情况,这在ABO血型等检验中常用,在DNA检验中较少用。阴性对照的检验结果应该没有DNA谱带,一旦发现结果中有谱带出现,就表明有DNA污染的存在。

    阴性对照可以监测检验中发生的系统污染,但对于发生在特定样品检验中的偶然污染无能为力,还要靠其它的监测办法。

3.1.2 阳性对照 

    阳性对照是指在平行实验中设置已知分型的DNA样本,主要用于监测DNA分型结果的可靠性和准确性。用于阳性对照的DNA样本可以使用参考标准物质,如A9947或K562等[10],也可以使用实验室中已知分型的自制DNA样本。当阳性对照的检验结果产生多余的等位基因时,表明有DNA污染的存在。

3.2 核查DNA图谱质量

    核查DNA检验结果的图谱质量是发现是否存在DNA污染的又一方法。核查DNA图谱的方法主要是看DNA结果中是否有多余的谱带或明显不符合逻辑的结果。以下几种情况值得注意:

1)对于等位基因标准对照物污染的情况比较容易发现,在某一或某些基因座的分型结果中如果包含的等位基因如同Ladder一样,就要考虑可能发生Ladder的污染。

    这是实验室中发生的比较严重的一类污染,一般多发生在PCR反应的操作中。

2)对于已知嫌疑人的比对样本,只应该是一个人的DNA图谱,如果结果中发现有明显多余的谱带存在,就要考虑有DNA污染的发生。

3)当核查DNA图谱时,如果发现人员样本与DNA检验结果在性别上不同时,要加以注意是否存在DNA污染或弄错样本编号的情况。

4)在DNA检验结果中,不是只要有多余的谱带都是由于DNA污染造成的,有些多余谱带是与生物技术或检测技术相关的,如影子带(stutter)、加A不完全、荧光洇渗(pull2up)、模板量太多等造成,要注意加以区别和分析[11]。5)阴性对照发生污染时,要注意核查检验样本的DNA分型是否含有阴性对照污染的等位基因。

3.3 DNA数据库的检索比对

    DNA检验结果的数字化使得DNA数据库的建设发展迅速,利用DNA数据库的自动比对功能,把DNA实验室获得的所有DNA分型进行数据库管理,可以发现DNA实验室中可能存在的一些污染。

3.3.1 DNA排查数据库 

    DNA排查数据库(elim2inationdatabase)是储存需要排除的相关人员DNA分型的数据库,用于监测和发现DNA检验结果是否受到相关的现场或实验室人员污染。英国的国家DNA数据库(NDNAD)是世界上最早、最大、发挥作用最好的数据库,其中建立了现场警员排除库(PED)、实验室人员排除库(SED)和耗材生产人员排除库(MED),用于检查实验室的DNA检验结果是否受到相关人员的污染。许多DNA实验室都建立技术人员的DNA分型数据库,用于检测技术人员自身的DNA污染,但是在国内,目前还未建立现场勘查人员和耗材生产人员的DNA排查库,无法对这些人员进行排查,只在特殊案件的检验结果中才会考虑进行个案排查。

3.3.2 同批次样本间的比对 

    DNA交叉污染和样品

    编号混淆也是DNA实验室中偶尔发生的问题,对同批次检验样本间的DNA分型结果进行比对可以用来发现此类错误。英国FSS使用的I23专家分析管理软件就具有这一功能,对同批次检验的DNA结果相互比对,发现可疑的比中记录后进行认真的核查来确定每次检验的大量样本间是否存在交叉污染的情况。对于国内的DNA实验室,可以在出具鉴定结论之间,将DNA分型先录入DNA数据库进行自动比对,如果发现DNA分型相同的样本来自同批次检验,且前期没有相互关联的信息,就要进行认真的核查。

4 DNA污染的纠正

    DNA污染的结果会影响DNA鉴定的质量,降低鉴定结果的侦查和证据价值,严重时会造成鉴定结论错误,产生错案。DNA实验室一旦发现有DNA污染的存在,就要认真查找污染源,分析造成的原因,提出解决方案,同时还要对这一时期获得的DNA数据进行复核,查找是否存在未被发现的污染情况。

    DNA实验室在查找污染原因时,可以设计一系列的阴性对照试验对检验过程中使用的所有试剂逐一进行排查,丢弃发现有问题的试剂;也有的实验室为了方便,丢弃污染时所有使用过的试剂,重新配制新试剂进行检验。DNA污染发生后,还要清洁所有的工作台面和仪器设备表面。

    当DNA实验室发生的PCR污染不是由于试剂原因造成,结果又难以解释时,要考虑PCR产物形成气溶胶造成污染的情况,这类污染往往难于去除。小的DNA分子达到一定数量时很可能会包含在气溶胶的颗粒上,污染DNA扩增区域的环境,从而造成PCR污染。实验室一旦发生PCR污染,要对扩增区采取清洁台面、通风透气、紫外照射等办法进行彻底地处理,一般所需时间较长,会对DNA鉴定工作产生影响。为了不影响工作,必要时可在DNA实验室之外的其它实验室进行DNA扩增。

    当对DNA鉴定结论产生怀疑时,条件允许的情况下可以采用重新检验的方法进行验证,这是纠正DNA污染的另一方法。当两次检验的结果相同时,应该认为DNA结果是可靠的;当两次结果不同时,要认真分析原因后再考虑进一步采取的措施。如果是同一个体来源的样本出现两次结果的不同,则肯定有错误发生;如果发生在现场提取的物证检材上,由于DNA检验对检材是消耗性的,则要分析检材上是否存在不同来源的DNA。

    DNA污染是产生DNA鉴定结论错误的重要因素,法医DNA实验室要努力去解决这一问题。但是,DNA污染不仅发生在DNA实验室的检验环节,还有可能发生在物证检材的提取过程中,也有可能发生在用其它物证技术对物证检材进行检验之时。所以,随着法医DNA技术的广泛应用,对DNA污染的防范不单是DNA检验人员的职责,而是所有法庭科学技术人员共同的责任,应引起高度重视,以使现场提取到的物证检材发挥应有的价值。

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